用慢病毒篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，以G418篩選方法為例，篩選出穩(wěn)定整合Neomycin抗性基因的細(xì)胞系。
A、 G418抗生素*優(yōu)濃度篩選
每種細(xì)胞對(duì)抗生素的敏感性不同，因此，準(zhǔn)備建立穩(wěn)定細(xì)胞系之前，需要確定能夠在10-14天殺死細(xì)胞的*佳濃度。
方法如下：
1、將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/mL，接種到24孔板，每孔1ml。
2、接種后**天在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。3、每隔3天跟換1次培養(yǎng)液，保持G418濃度不變。
4、選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的*低G418濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，一般變動(dòng)在100ug/ml～1000ug/ml范圍。
B. 慢病毒感染細(xì)胞和穩(wěn)定細(xì)胞系篩選
1、在6孔板培養(yǎng)皿內(nèi)種植約5×10^4細(xì)胞CO2 孵箱培養(yǎng)24小時(shí)。
2、準(zhǔn)備 3ml 培養(yǎng)基，加入Polybrene，終濃度為6-8 μg/ ml。將制備好的適量病毒顆粒加至上述培養(yǎng)基，輕吹混勻。去除舊的培養(yǎng)基，加入含病毒培養(yǎng)基。
3、病毒感染后 24小時(shí)，用新鮮的完全培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
4、換用含*優(yōu)濃度G418 的培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞敏感性不同，以后每隔3-5天換用新鮮的含有G418的培養(yǎng)基，以替換含大量死細(xì)胞的培養(yǎng)基。待抗性細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)以后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入10cm 培養(yǎng)皿，同時(shí)，留一部分細(xì)胞在原來(lái)的60mm 平皿內(nèi)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，收獲細(xì)胞，在蛋白或mRNA 水平鑒定基因過(guò)表達(dá)或敲低效率。
Polybrene 配制：用 0.9%的NaCl 溶解Polybrene 干粉（濃度為10 mg/ml），高壓滅菌，可以在4 ℃穩(wěn)定存放1 年，也可凍存于-20℃。干粉可以在4 ℃ 穩(wěn)定存放數(shù)年。
G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過(guò)濾消毒，4度保存。
