實驗十四 細胞集落形成實驗
非整倍體無限細胞系和癌細胞株中，仍然存在不同細胞亞群，它們的功能和生長特點有些差異，其中有些亞群細胞對培養環境有較大的適應性和具有較強的獨立生存能力，細胞集落率高。純化細胞群來自一個共同的祖細胞，細胞遺傳性狀、生物學特性相似，利于實驗研究。原代培養細胞和二倍體有限細胞系，細胞集落率很低。細胞集落化培養之前，應先測定細胞集落形成率，以了解細胞在極低密度條件下的生長能力。
目前認為僅有腫瘤干細胞具有形成集落的能力，集落抑制率常用于**藥物敏感試驗、腫瘤放射生物學試驗。
集落抑制率=（1-（實驗組集落形成率/對照組集落形成率））×100%
（一）原理
細胞集落形成率 單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細胞，大小在0.3-1.0mm 之間。集落形成率表示細胞獨立生存能力。常用方法有平板集落形成試驗、軟瓊脂集落形成試驗。
（二）實驗用品
1.材料：Hela細胞。
2.器材：（直徑 60mm ）培養皿、細胞記數板、燒杯、吸管、離心機、離心管、廢液瓶、倒置顯微鏡、二氧化碳培養箱、超凈工作臺、水浴鍋。
3.試劑：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清細胞培養液、安爾碘、瓊脂。
（三）方法
1.平板克隆形成試驗
本法適用于貼壁生長的細胞，包括培養的正常細胞和腫瘤細胞。
(1)對指數生長期細胞，采用常規消化傳代方法，制成細胞懸液。
(2)細胞懸液反復吹打，使細胞充分分散，單個細胞百分率應在95%以上。細胞記數，并用培養基調節細胞濃度，待用。
(3)根據細胞增殖能力，將細胞懸液倍比稀釋。一般按照每皿含50、100、200個細胞的濃度分別接種5ml細胞懸液到培養皿（直徑 60mm ）中，以十字方向輕輕晃動培養皿，使細胞分散均勻。
(4)培養皿置 37℃ 、5%CO2中培養2~3周，中間根據培養液pH變化適時更換新鮮培養液。
(5)當培養皿中出現肉眼可見克隆時，終止培養，棄去培養液，PBS液小心浸洗2次，空氣干燥。甲醇固定15分鐘，棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10分鐘，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。
2.軟瓊脂集落形成試驗
本法適用于非錨著依賴性生長的細胞，如骨髓造血干細胞、腫瘤細胞株、轉化細胞系。利用瓊脂液無粘著性又可凝固的特性，將腫瘤細胞混入瓊脂液中，瓊脂液凝固使腫瘤細胞置于一定位置，瓊脂中腫瘤細胞可能向周圍作全方位的移動，因此可以用來檢測腫瘤細胞的主動移動能力。腫瘤細胞在適宜培養基中又可以增殖，從而可以測定腫瘤細胞克隆形成率。造血系統軟瓊脂集落形成試驗方法相同，主要用于有關細胞分化的研究，但使用培養基不同。
（1）同上（1）~（3）步驟。
（2）調整細胞懸液密度為1×103個/ml細胞。
（3）制備底層瓊脂，完全溶化的5%瓊脂和 37℃ 左右預溫的新鮮完全培養液以1：9比例在 40℃ 均勻混合，加入培養皿（直徑 60mm ）中，每皿含0.5%瓊脂培養基2ml，室溫下瓊脂完全凝固。
（4）制備上層瓊脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200個)的細胞懸液1.5ml移入小燒杯中，加入 40℃ 、5%瓊脂等體積混勻，即成0.25%半固體瓊脂培養基。配好的半固體瓊脂培養基立即加入鋪有底層瓊脂的培養皿中，室溫下瓊脂凝固。 37℃ 、5%CO2靜置培養2-3周。
（四）實驗結果
1.定期觀察細胞培養過程中集落的形成。
2.顯微鏡下計數大于50個細胞克隆數，然后按下式計算集落形成率：
集落形成率（%）=（集落數/接種細胞數）×100
（五）注意事項
1.瓊脂對熱和酸不穩定，如果反復加熱，容易降解，產生毒性，同時瓊脂硬度下降。故瓊脂高壓滅菌( 10磅 15分鐘)后按一次用量進行分裝。
2.細胞懸液中，細胞分散度>95%。
3.軟瓊脂培養時，注意瓊脂與細胞混合時溫度不要超過 40℃ ，以免**細胞。
4.接種細胞密度不宜過高。
5.細胞在低密度條件下培養，生存率明顯下降，無限細胞系和腫瘤細胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培養細胞和有限細胞系僅為0.5~5%,甚至為零。為提高集落形成率，必要時在培養基中添加胰島素、地塞米松等促細胞克隆形成物質。
（六）復習思考題
比較平板克隆形成試驗和軟瓊脂集落形成試驗的異同。
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